306医院医学科普TB大蒜素对炎症性肠病的治疗作用( 二 )

本文插图
内容包括：
1、用TNBS诱导大鼠IBD模型；
2、观察大蒜素单独使用及分别与美沙拉嗪、柳氮磺吡啶联合使用的疗效；3、在IL-1β诱导的Caco-2细胞中检测大蒜素作用后MAPK通路的变化。
方法1、80只Wistar大鼠分为空白对照组、TNBS模型组、大蒜素预防组(30mg/kg)、美沙拉嗪组(30mg/kg)、柳氮磺吡啶组(100mg/kg)、大蒜素灌胃组、美沙拉嗪联合大蒜素组、柳氮磺吡啶联合大蒜素组。大蒜素预防组在造模前以30mg/kg大蒜素灌胃,共2周。造模当日以50mg/kg TNBS乙醇溶液灌肠。造模24h后,空白对照组、模型组及大蒜素预防组大鼠分别以生理盐水灌胃；美沙拉嗪组以30mg/kg艾迪莎混悬液灌胃；柳氮磺吡啶组以100mg/kg柳氮磺吡啶混悬液灌胃；大蒜素组以30mg/kg灌胃；美沙拉嗪联合大蒜素组及柳氮磺吡啶联合大蒜素组分别为二者混悬液,剂量同上；每日1次,时间固定,持续14d 。记录各组大鼠体重变化,肉眼及内镜观察结肠大体改变,用光学显微镜观察大鼠结肠病理学变化。 ELISA检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。 2、选取Caco-2细胞株,利用不同浓度及时间的大蒜素、IL-1p处理细胞,MTT检测,确定安全范围。细胞接种于直径60mm培养皿中,分组：孔白对照组、0.1ng/ml IL-1β组、1ng/ml IL-1β、10ng/ml IL-1β组、10μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β组(含大蒜素组处理时先加入大蒜素,2h后加入IL-1p使终浓度为1ng/ml,持续培养至相应时间),各培养12h、24h、48h后收集细胞上清、核蛋白。接种细胞于六孔板中,分组：空白对照组、1ng/mlIL-1β组、25μg/ml大蒜素组、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β组,培养24h后收集细胞全蛋白。 ELISA检测细胞上清IL-8水平；Western blot检测细胞核NF-κB p65含量及MAPK各通路磷酸化水平变化。 3、统计：数据均用均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软处理。组织评分数据进行多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis H Test) 。计量资料比较,方差齐性时采用One-way ANOVA检验,组间多重比较采用LSD-t检验；方差不齐时采用近似方差分析法Welch法,组间多重比较采用Dunnett T3检验；细胞上清IL-8浓度采用析因资料设计的方差分析。 P<0.05表示差异显著,有统计学意义。结果1、大鼠体重：TNBS造模组2天后体重低于对照组。各治疗组大鼠体重较造模组均有升高。大蒜素灌胃组、柳氮磺吡啶联合大蒜素组与美沙拉嗪联合大蒜素治疗组体重无显著差异；至实验结束,大蒜素灌胃组、美沙拉嗪组与美沙拉嗪联合大蒜素组大鼠体重无显著差异。 2、组织HE染色评分：造模组、大蒜素预防组、各治疗组评分均高于空白对照组,显示造模成功；与造模组比较,大蒜素预防组、各治疗组评分均低于造模组,显示预防和治疗都有显著保护作用,联合美沙拉嗪使用,组织评分在治疗组中最低。 3、TNBS组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平较空白组显著升高；各治疗组TNF-α、IL-1β水平较TNBS组均有下降,但仍高于正常对照组；美沙拉嗪组、柳氮磺吡啶组无显著差异；美沙拉嗪联合大蒜素组二者含量最低。 IL-4、IL-10水平在TNBS造模组显著降低；与造模组相比,各治疗组IL-4水平均有升高但低于对照组,美沙拉嗪联合大蒜素组IL-4水平高于其它治疗组；IL-10水平各治疗组间无显著差异。 4、梯度浓度的IL-1β刺激Caco-2细胞12h、24h、48h,ELISA检测见细胞上清IL-8含量在一定范围内随IL-1β浓度增大及作用时间延长而增加。核蛋白western blot分析见：NF-κB p65亚基含量随IL-1β浓度增大而增加。加入大蒜素预先干预后,核蛋白中NF-κB p65亚基含量较对照组升高,但相比1ng/ml IL-1β组,表达量有下降,25μg/ml大蒜素组下降更显著；但上清IL-8含量变化不大。该趋势在12h、24h、48h一致。 5、1ng/ml IL-1β可以激活p38、ERK、JNK通路；提前2h加入25μg/ml大蒜素可减弱p38、ERK通路的活化,但可激活ERK通路；单独加入25μg/ml大蒜素并不引起p38、JNK通路变化,可激活ERK通路。因此,大蒜素可抑制炎症情况下p38、JNK的磷酸化,增强ERK活化。