ZipChip：快速鉴定单抗生物治疗技术的完整分析方法解决方案—— 概览 ———— 实验方法 ———— 实验结果 ———— 总结 —— ：ZipChip：快速鉴定单抗生物治

原标题：ZipChip：快速鉴定单抗生物治疗技术的完整分析方法解决方案
——概览——本文介绍了一种采用ZipChip平台进行单克隆抗体(mAb)分析的方法。 ZipChip是美国908Devices公司推出的一款将微流控芯片区带电泳(microchipzoneelectrophoresis,简称MZE)分离完整单抗电荷变异体与直接电喷雾电离质谱(ESI-MS)结合的分析平台。
该方法的主要优点包括：
【ZipChip：快速鉴定单抗生物治疗技术的完整分析方法解决方案—— 概览 ———— 实验方法 ———— 实验结果 ———— 总结 ——】·无需复杂的样品制备，简单的稀释步骤即可上样分析；
·电荷变异体的高分辨、快速分离与在线质谱鉴定；
·温和的、原态条件下的快速完整抗体分析；
·高质量的MS数据；
·单一的电荷异质性、质量信息和糖型的表征。
ZipChip平台通过微流控技术将样品注入sampleinjection、电泳分离(capillaryelectrophoresis,CE)和电喷雾电离(electrosparyionization,ESI)无缝衔接的集成到一块简单的玻璃芯片上。通过ZipChip平台内对芯片施加精确控制的电压和气压来实现电泳的分离和电喷雾电离，更为具体的操作方式和分离原理可以参考本公众号发布的文章《ZipChip:WhatTheyAre&HowTheyWork》ZipChip提供了一种非常简单、快速、与质谱仪离子源相同的安装方式，可以直接安装到目前的主流质谱仪，包括ThermoFisher的QExactive系列、FusionLumos系列、OrbitrapElite系列、LTQOrbitrabX、TSQ系列以及SCIEX公司的三种四极杆质谱仪6500、5500系列等。 ZipChip其优化的ESI喷雾羽流与质谱仪采样接口之间的对接方式，保证了单抗分子电荷变异体的高灵敏度检测。
基于ZipChip的完整抗体分子分析平台可以通过最少量的样品制备，实现mAb变异体的接近基线分离的高分辨率，并且每一个电泳图对应有高质量的质谱数据，结合解卷积(deconvolution)后的质谱图可以识别和鉴定被分离的每个电荷变异体。本文中的实验方案采用NISTmAb单抗作为样品，该单抗是一个免疫球蛋白IgG1k ，用于模拟从细胞培养到生物治疗药物制剂的寿命，因此，该样品是对于基于IgG类的生物药的一种非常有代表性的标准分析物。本文介绍的方法广泛适用于mAb分子和制剂，为这些样品提供高质量的质谱图和超凡的结构变异体的高分辨分离。
——实验方法——1.样品制备
NISTmAb标准参考物(RM8671 ， NIST)用于本工作的分析样品。用色谱纯级别的水将样品mAb(浓度10mg/mL)稀释至0.5mg/mL进行分析。 ZipChip分析无需对样品进行换液处理(nonecessaryforbufferexchange) 。
2.ZipChip分析参数
ZipChip系统分析参数列于表1中，采用的芯片为HR高分辨芯片，关于芯片的详细参数可以通过文末联系方式联系上海仁科生物。

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3.质谱仪参数
实验数据是用ThermoScientificExactivePlusEMR质谱仪获得。表2列出了用于分析的质谱仪参数。该仪器采用EMR模式，最大限度地提高了对高质荷比离子的束缚效率，提高了对完整mAb的检测灵敏度。另外，采用源内CID和HCD碰撞能显著改善质谱的质量。需要说明的是，在正常工作模式下或使用不同型号的Orbitrap质谱仪时，碰撞能量需要不同的设置。

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4.数据处理
质谱数据通过ThermoScientific公司的BioPharmaFinder1.0SP1软件进行解卷积处理。
——实验结果——图1显示完整的NISTmAb标准物的电泳总离子谱图(basepeak模式) ，整个ZipChip的分析在3.50分钟内完成。 10μL的样品加载到样品储液池中，但分析时芯片内的样品注入体积小于1.0nL ，对应大约325pg的样品。三个主要的mAb变体(图1中的峰1、2、3)被分离，平均分辨率为1.45 。该方法中，单抗的变异体所带电荷数量越多，或者碱性更强，其电泳过程中的迁移速度就越快，迁移时间越小。迁移时间的减少表明该变异体所带净电荷的减少，因此，从ZipChip的分离结果可以推断，峰1比主要变异体峰3有更高的净电荷。

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图1.完整NIST单抗电荷变异体的ZipChip分离电泳谱图，插图(a)为三个主要变异体峰1-3的放大图，其中峰4为强度较弱的酸性变异体；插图(b)为较小的蛋白组分峰5-8的放大图。
利用ZipChip接口，电荷变异体的分离直接与在线的电喷雾质谱ESI-MS集成。通过对电泳谱图中单个峰宽的时间内产生的质谱图进行平均处理，可以获得电泳分离中的每个峰的质谱图。图2所示的质谱即是通过对主变异体峰3所覆盖的时间宽度内的质谱图的平均来生成的。如图中所标记的，检测到的风度最高的峰对应的电荷态是31到28 ，第二组峰以电荷态+36的峰为中心。用于此分析的背景电解质(BGE)比典型的变性条件的BGE含有更少的有机改性剂和酸，使mAb在溶液中的展开较少，大部分样品处于原始的折叠状态。这使得电荷状态更接近于用原态电喷雾MS实现的状态。