ZipChip：快速鉴定单抗生物治疗技术的完整分析方法解决方案—— 概览 ———— 实验方法 ———— 实验结果 ———— 总结 ——( 二 ) ：ZipChip：快速鉴定单抗生物治

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图2.NIST主变异体峰3对应的质谱图，通过峰3对应的时间范围内的质谱图的平均谱，插图为+29价态的质谱峰的放大谱图。
每个变异体的质谱通过电泳分离的峰对应的时间段的平均质谱来产生，然后用BiopharmaFinder软件解卷积。图3提供了图1中1、2、3号峰的解卷积谱图，并标记了一些已识别的糖型结构。表3列出了分离中检测到的峰值和去卷积后质量数的结果统计。通过这种方法，可以很容易地检测到三种电荷变体之间的质量数差异为127Da 。这种质量差异对应于一个已知的、会引起mAb的净电荷的变化的特征化改变，就是单抗分子重链的C-末端的赖氨酸切断。比较1-3峰的电泳迁移时间和表3中去卷积后质量数，会发现127Da的质量的减少确实是与迁移时间的减小伴随发生的，表明净电荷数量的减少。综合上述两点特征，可以证实，丰度最高的变异体来自于mAb结构中重链C端赖氨酸切断。

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图3.NISTmAb电荷变异体的解卷积质谱图,其中Peak1、Peak2和Peak3的质谱图分别对应图1中峰1、峰2和峰3
在ZipChip电泳谱图中还检测到一个低丰度的酸性变异体信号,即图1中的4号峰， 3号和4号峰对应变异体(~1Da)的质量数非常接近，这表明脱酰胺可能是引起净电荷减少的一种结构上的编号。对于这种尺寸大小的蛋白质，在带有+29个电荷的状态下， 1.0Da左右的的质量位移引起的质荷比的差异(m/zdifference)仅有0.03 。这种微小的差异在质谱的质量数域(massdomain)是很难分辨以及进行精确的去卷积处理的，反而会使得在完整抗体层面上的对去氨基化的鉴定变得更加复杂。然而， ZipChip提供的微流控毛细管区带电泳中的分离有效的展示了这种酸性变异体的存在。
ZipChip平台对于所分析的NIST标准物样品，除了主要完整的mAb变异体外，还检测到较小的蛋白质种类，见图1(b)中编号为5、6、7、8的峰，这些物质在3.20到3.40分钟之间迁移出芯片，从mAb变异体中可以很好地分辨这些峰。通过解卷积得到这些蛋白质的质量数在47kDa左右(如表3所示) ，与NIST单抗的轻链或重链的理论质量并不一致。因此，我们推测这些物质是一些残留的宿主细胞蛋白。

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——总结——ZipChip平台针对完整单的抗分析，实现了完整电荷变异体的分离以及电喷雾质谱ESI-MS分析。该方法无需样品制备，仅需将样品稀释到适当的浓度。该方法使用的背景溶液BGE的条件使微流控电泳可以实现对通过电喷雾电离产生的净电荷数量相差1和近似原态的电荷态的分离。质谱上足够高的质量分辨率，可以迅速地完成对完整的mAb变异体的糖型的表征。从去卷积谱图中获得的完整质量数信息结合来自ZipChip分离的电泳迁移率的分析结果，电荷变异体的识别具有更高的确定性和选择性。该方法已经成功鉴定了多个单抗变异体（包括Cetuximab,Trastuzumab）并对其中低丰度的碱性和酸性变异体进行了有效鉴定。 ZipChip通过将高速微流控芯片区带电泳分离、芯片电喷雾电离和质谱分析集成到一个自动化工作流程中，该方法实现了极其快速、简单和耐用的单抗生物药的分析。
ZipChip提供了一种不同关于传统液相色谱的分离机制，在很多应用中展示了独特的优势，进一步解锁了传统质谱的潜能。本公众号将转载ZipChip在不同应用领域的解决方案。目前， ZipChip已经全面进入中国市场，上海仁科生物科技有限公司作为908Devices中国区独家授权代理商，欢迎联系我们，邮箱:marketing@bio-star.cn 。