来自测量GST 一、测量酶活性的实验注意事项( 三 ) _做好westernblot需要注意各种细节，转给需要的你！

3.在电转的同时，可以配制以下液体，事先根据膜的数量计算好所需体积：
以一块膜为例，封闭5ml+稀释一抗4ml+稀释二抗4ml，需要13ml，则配制15ml 。
5% BSA溶液(w/v)：配制15ml 5% BSA溶液(w/v)，称取0.75g BSA晶体，溶于15mlTBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存（若目的蛋白为磷酸化蛋白时配制）。
5%牛奶(w/v)：配制15ml 5%牛奶(w/v)，称取0.75g脱脂奶粉，溶于15ml TBST中，漩涡振荡器混匀，现用现配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用时将100×TBST用双蒸水稀释至1×，常温保存。
Little Trick
1.关于电转膜，有些使用NC膜。我没有尝试过NC膜，但隔壁实验室使用NC膜多次WB结果仍不理想，换用PVDF膜后有所改善。因此建议还是使用PVDF膜，可购买Millipore的PVDF膜，一卷有些贵，但是可以够一个实验室用好几年哪。最好不要在经销商购买分装的的PVDF膜，另一实验室一同学想着价格便宜也就只做几次，就从试剂公司只买了100cm2的膜，结果这价格虚高不说，而且膜还是假的，直到做完实验了才发现，蛋白样品也浪费了。所以建议还是购买Millipore公司原装的PVDF膜。
2.关于电转方式，有些采用湿转，有些采用半干转，两种方式均可。个人觉得半干转方便简捷些。
1.电转结束后，根据maker位置和目的蛋白及内参大小剪膜。可在标有maker的一边左上角剪一个小角，以清楚哪一条带是1号样品。
2.分别用已配好的5% BSA和5%牛奶封闭目的蛋白和内参，室温摇床上孵育2h 。根据盒子大小，加入封闭液的量需没过膜。
1.配制p-STAT1一抗（公司），1:500稀释，加入上述配制的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混匀，现配现用。
配制actin一抗（公司），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。
2.将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。
次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。将膜放入1×TBST中，摇床上清洗三次，每次10min 。
1.配制具有种属特异性的HRP标记的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混匀，现配现用。
2.TBST洗完膜后，加入二抗，室温摇床上孵育2h 。
1.二抗孵育完后，回收，-20℃保存。1×TBST摇床上洗膜三次，每次10min 。
2.一条目的蛋白即一张膜需要100ul发光液A和100ul发光液B，根据膜数计算用量，提前4℃混合好发光液A和B 。
3.到暗室中加混合好的发光液，在胶片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光胶片，可分别不同时长曝光，如15s，30s，1min，5min等，然后在显影液和定影液中显影，放入自来水中。出暗室后，将胶片挂起晾干。
也可用Bio-rad凝胶成像系统照相，选择不同的曝光时间成像。
Little Trick1.需通过不同曝光时间探索某蛋白最佳曝光时间，多次重复实验即可采用此曝光时长。我最开始也是在暗室中显影，后来用Bio-rad凝胶成像系统照相，对比结果发现后者的结果更加清晰明显，背景也更加干净，之后就一直用成像仪曝光照相了。
2.夹取胶片可用普通镊子，但也只夹胶片左上角，避免损害胶片上曝光的蛋白条带。
3.胶片左上角maker一侧一定要剪一小角或做其它标记，才可在显影后明显对应各个样品。
4.若暗室曝光，可能内参蛋白发光液刚加上就出现很亮的条带，这时最长曝光15s已经足够。
若显影效果不好，可将膜重生，再次显影，省去了配胶、电泳和电转等步骤。
1.加4ml蛋白印迹膜再生液，室温摇床30min 。
漩涡振荡器与旋转混匀仪有什么区别摇床培养的作用： 1.传质，就是底物或代谢产物更好在体系内转移和发挥作用。
2.溶氧，在好氧培养过程中，空气是滤过开放的，所以通过摇到可以让更多空气中氧气溶解于发酵液中。
厌氧则不是这个作用了。
3.体系均一，有便于对不同参数的取样测定。
rna稀释后可以震荡混匀吗可以。
?1、准备工作
_ 玻璃匀浆器、75_乙醇预冷，离心机预冷至4℃ 打开超净工作台紫外灯15分钟以上
_ 用酒精擦拭台面 EP管标记
?2、匀浆处理
?1）取一定量的纯化过的孢子悬浮液，12000rpm，离心5min，弃上清