_ 或者用匀浆仪进行匀浆处理，悬浮液不经离心，直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.，然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器，转移至1.5ml EP管中
_ 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞，加1ml Trizol.用取样器吹打几次.（离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol 。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA 。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理）
?2）1ml Trizol Reagent，震荡混匀
?3）将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离 。
?4）可选步骤:4 ℃ 12 000rpm离心10min，取上清 。
_绻分泻薪隙嗟鞍住⒅尽⒍嗵腔蚣∪狻⒅参锝峤诓糠值龋衫胄娜コ＠胄牡玫降某恋碇邪ㄏ赴饽ぁ⒍嗵恰⒏叻肿恿_NA，上清中含有RNA 。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去 。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作 。
?5）每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，在漩涡振荡器上震荡15s，室温放置3min 。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替 。
?6）4 ℃ 12 000rpm，离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中 。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相）
?7）在得到的水相溶液中加入等体积（500ul）的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃ 放置20-30min 。
_ㄖ参锘蚨镒橹_NA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA 。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作 。）
?8）4 ℃ 12 000rpm离心10min，去上清 。
_ɡ胄那_NA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀 。）
?9）加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀 。加入后把管子敲一敲，尽量使RNA沉淀飘起来，每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇 。有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解 。
?10）4 ℃ 12 000rpm离心5min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀 。
?11）室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可） 。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA 。50度保温1小时 。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液 。RNA也可用100_ 的去离子甲酰胺 。溶解，-70℃保存 。可以分装保存，防止污染，
?12）取1ul+1ul buffer 电泳检测RNA完整性，稀释一定倍数，分光光度计测定纯度和浓度 。
甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案的本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的 。
一、标本的采集种类和要求
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液 。气管插管的病人也应收集气管吸取物 。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室 。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件 。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单 。（附表1）
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄 。不推荐棉拭子和木柄 。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）
3、临床标本储存要求
保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下 。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下 。不应保存在-20℃ 。
4、标本的分装处理
标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融 。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核 。
5、标本的运输
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输 。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2） 。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用 。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：
【来自测量GST 一、测量酶活性的实验注意事项】